دستورالعمل اصول نمونه برداري ماهی، روش آماده سازي نمونه

دستورالعمل اصول نمونه برداری روش آماده سازی نمونه

این ضمیمه به بررسی روشهای آزمایش مورد استفاده در طرح و روش های آماده سازی نمونه جهت انجام آزمایشات مذکور می پردازد .

روش های آزمایش :
۱- Nested –PCR
۲- (S.N.T)
۳- کشت سلولی ویروسی (Cell culture)
۴- باکتری شناسی کشت باکتریایی درمحیط های T.S.A,B.A

روش آماده سازی نمونه :
۱ – آزمایشات تشخیصی :
پس از اخذ تعداد لازم نمونه جهت انجام آزمایشات تشخیصی که حداقل ۱۰ عدد ماهی در حال مرگ (moribund) یا دارای علائم کلینیکی می باشد، انتخاب و به شرح ذیل آماده سازی و مورد آزمایش قرار می گیرد .
درابتدا بایستی برای انجام آزمایش باکتریایی، پس از قطع سر هر ماهی از پشت آبشش یا پس ازکالبد گشائی و کنار زدن احشاء توسط چاقوی استریل بایک آنس استریل از کلیه قدامی بر روی محیط های T.S.A,B.A کشت داده شود و محیط های کشت درانکوباتور ۲۲ درجه تا زمان رشد کلنی های مشکوک نگهداری شده و تا زمان ارسال به مرکز در یخچال ۴ درجه سانتی گراد نگهداری و با حفظ زنجیره سرد جهت آزمایشات تفریقی- تشخیصی ارسال گردد .سپس ۱۰عدد ماهی به دو دسته ۵تایی تقسیم شده درهر دسته اندام های خونساز همچون کلیه قدامی، کبد، طحال، قلب و نیزمغز هرماهی را جدا ساخته ودر هاون استریل مخلوط میگردد (بطوریکه مخلوط حاصل ، ازحالت جامد بافتی خارج نشده و بافتها قوام خود را حفظ نمایند) سپس ازمخلوط بدست آمده در هر یک از محیطهای VTM (کشت سلولی ویروسی وSNT) (توضیح اینکه محیط VTM حاوی محیط EMEM + آنتی بیوتیک + ژلاتین + FBS می باشد) و اتانول %۲۰ (PCR) (جهت انجام آزمایشات کشت سلولی، (S.N.T) و PCR به مقدار۱/۵ گرم و به نسبت قرار داده و دراسرع وقت (حداکثر تا ۲۴ ساعت) با حفظ زنجیره سرد به مرکز ارسال گردد. لازم به ذکراست که برای تهیه یک نمونه واحد، بافتهای هدف ۵ عدد ماهی دیگر نیز به همین ترتیب به داخل همان نگهدارنده ها اضافه می گردد و به این ترتیب از ۱۰عدد ماهی دو سری نمونه برای آزمایشات مورد نظر بدست می آید.
تذکر : نمونه برداری نبایستی از ماهیان تلف شده صورت گیرد .

۲ – آزمایشات غربالگری :
بر طبق جدول نمونه برداری طرح، تعداد ۶۰ قطعه مولد و تعداد ۶۰ نمونه لارو یا بچه ماهی (در ماهیان زیر گرم هر ۱۰ عدد بچه ماهی، یک نمونه تلقی می شود) انتخاب شده از هر بهرجمعیت را که نماینده کل مجموعه می باشد، برای انجام آزمایشات مربوطه به شرح ذیل آماده سازی می نمائیم .
الف) مولدین :
تعداد ۶۰ قطعه مولد، بایستی انتخاب شده و پس از انجام مراحل آماده سازی، با روش مکانیکی نسبت به اخذ ۱ سی سی مایعات جنسی از هر مولد اقدام و در داخل فیکساتیوهای اختصاصی هر آزمایش قرار گیرند بدین شکل که : نمونه های اسپرم و مایع تخمدانی اخذ شده بایستی به صورت جداگانه در دو ظرف استریل جمع آوری و توسط یک همزمن استریل به آرامی مخلوط گردند سپس از مخلوط اسپرم، در داخل دو لوله استریل هر کدام یک سی سی ریخته و منجمد (۲۰- درجه سانتی گراد) گردد (یک لوله با درج همان کد ارسالی به عنوان نمونه بایگانی در فریزر آزمایشگاه استان نگهداری شود) سپس از مخلوط مایع تخمدانی وتخم، در داخل دولوله استریل و یک لوله حاوی محیط VTM به مقدار یک سی سی ریخته شده و لوله حاوی محیط تا زمان ارسال در یخچال c° ۴-۰ نگهداری می گردند .(یک لوله استریل با درج همان کد ارسالی به عنوان نمونه بایگانی در فریزر آزمایشگاه استان نگهداری شود) و نیزاز هر یک از مخلوطهای فوق بر روی B.A و T.S.A کشت می دهیم و پلیت های کشت را در انکوباتور ۲۲ درجه نگهداری کرده و پس از آن اقدام به انجام آزمایشات تفریقی و تکمیلی مینماییم .
ب) بچه ماهی :
تعداد ۶۰قطعه لارو یا بچه ماهی ، از مرکز مورد نظر به صورت اتفاقی (Random) انتخاب شده (در لاروهای زیر گرم هر ۱۰ قطعه لارو، یک نمونه تلقی می شود) و به شرح زیر آماده سازی می گردد .
۱- لاروهای زیر گرم :
پس از اخذ نمونه های لازم در محل نمونه برداری و تحت شرایط استریل، بصورت گروه های ده تایی در هاون استریل مخلوط کرده و بصورت مخلوط یکنواخت در می آوریم .سپس این مخلوط در داخل یک لوله حاوی محیط VTM به نسبت قرار می گیرد .
برای بررسی های باکتری شناسی در لاروهای زیر گرم، تعدادی لارو زنده را با شرایط تأمین اکسیژن به محل آزمایشگاه منتقل نموده ودر شرایط استریل و زیر هود و در کنار شعله، اقدام به کشت باکتریایی از اندام های درونی لاروها می گردد .
تذکر :
در لاروها و بچه ماهی های دارای کیسه زرده، بایستی، ابتدا جداسازی کیسه زرده صورت گرفته و سپس باقیمانده لاروها، بصورت مخلوط یکنواخت تهیه و آماده سازی گردد.
۱- لاروهای بالای گرم :
پس از اخذ نمونه های لازم بایستی ابتدا اقدام به کشت باکتریایی در شرایط استریل نمود، بدین شکل که پس از قطع سرماهی از پشت آبشش توسط چاقوی استریل، با یک آنس استریل از کلیه قدامی بر روی محیط های B.A و T.S.A کشت می دهیم .سپس اقدام به کالبد گشایی (برش در ناحیه Sagittal-Mid شکمی) نموده و به بافت های هدف دسترسی پیدا می کنیم .بافت های کلیه قدامی، کبد، طحال و قلب هر ماهی اخذ شده و در یک لوله حاوی محیط VTM (به نسبت) قرارمی گیرد در صورتی که حجم بافت های اخذ شده نسبت به حجم VTM بیشترباشد تنها بخشی از بافت های هدف جدا شده و در محیط VTM قرار می گیرد .